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超速離心法分離血清脂蛋白的一些方法
添加時間2021-03-29 09:49:07來源臥螺離心機廠家點擊量

為了生物及醫藥方面研究的需要,研究者常需制備脂蛋白純品,采用的方法有超速離心法、化學沉淀法(如硫酸右旋糖苷沉淀法)、凝膠過濾和高壓液相層析法等。迄今為止,采用密度梯度超速離心分離純化各種脂蛋白仍是純度較高、簡便實用的好方法。
超速離心法可分為制備型和分析型兩種,制備型密度梯度離心法可以分為等密度離心法和速率一區帶密度梯度離心法,可以選用的轉頭有角頭、甩平頭、垂直頭和區帶頭。我們介紹的方法利用不同容量的角式轉頭及簡單配制的梯度液,在各種型號的超速離心機上快速分離血清脂蛋白,可以得到滿意的分離效果。
一材料和儀器
1梯度液
A液:11.40gNaC1,0.1gEDTA—Na2,置于1000rnl量筒中,加入500ml重蒸水及1ml1NNaOH,混勻至全部溶解。加重蒸水至1000ml最后再加3rI1l重蒸水(NaCI:0.195mo1)。終密度1.O06g/cm~,pH10.37。
B液:力Ⅱ24.98gNaBr至U100mlA液中(NaC1:0.195mol,NaBr:2.44mo1)。終密度1.182g/cm3,pH9.72。
C液:加78.32gNaBr到100mlA液中(NaC1:0.195mol,NaBr:7.65mo1)。終密度1.478g/cm3,pH8.86。
2離心機、轉頭、離心管
(1)離心機:HitachiCP—MX系列超速離心機或其他類似機組。
HitachiCS一150GXL微量超速離心機(2)轉頭和離心管:S140AT:140,000rpm,l,050,000×g,10×2ml,K=5,1PC厚壁管。S80AT3:80,000rpm,415,000×g,8×8ml,K=23,6PC厚壁管。S70AT:70,000rpm,505,000×g,8×40ml,K=44,40PA管。
二,離心操作
1血漿一血球分離
全血,角轉頭或甩平轉頭3000rpm×20min,沉淀為血細胞,上清血漿待用。
2乳糜微粒分離
離心參數:各種轉頭均可用,4×106(g×min),10℃。
梯度液:離心管下部3/4容積為血漿,上部1/4容積為0.15MNaCl+0.3MEDTA,pH7.4。離心結果:乳糜微粒上浮,離心管傾斜,吸管貼管壁慢吸出(約占血漿容積的2%一6%)。
注意:禁食12h以上供血者血漿中乳糜微粒含量很低,餐后供血者含量較高。
以往文獻報道的密度梯度離心法常常指定離心機和轉頭,提供的方法不能推廣,且需要進行精確到小數點后4位的密度標定,過程繁瑣。我們采用等密度梯度分離,梯度液的配置簡便可行,不需要做密度測定或光折射率的換算。幾乎所有的超速離心機用戶都有角式轉頭,不論機型,均可參照本法用于離心分離脂蛋白,用戶只需根據所需容量靈活調整梯度液和樣品的量,并計算出離心時間即可。對大量樣品還可用同樣方法、同樣梯度液進行區帶分離。本法分離出的VLDL、LDL、HDL還可以進一步用長離心管縮小不連續梯度密度差,分離出其亞組分。需要注意配置梯度液時室溫應接近離心溫度,所用試劑最好達到分析純級。

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